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HPLC 法同时测定不同产地广陈皮中5 种活性黄酮成分

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admin 发表于 2013-11-12 11:19:24 | 显示全部楼层 |阅读模式

郑国栋1, 2 , 蒋 林1, 杨得坡1 , 周 芳3 , 杨 雪1 , 林乐维1

    ( 1 中山大学药学院生药与天然药物化学实验室, 广东广州􀀁 510006;2 广州医学院基础学院药学系,广东广州􀀁 510182; 3 湖南中医药大学药学院天然药物化学实验室, 湖南长沙􀀁 410208)

    摘􀀁 要: 目的􀀁 建立H PLC 法测定12 批不同产地广陈皮中5 种活性黄酮的量。方法􀀁 采用超声法提取药材, 通过对提取工艺及色谱条件进行优化建立测定方法, 同时测定不同产地广陈皮中橙皮苷(1) 、川陈皮素(2) 、3 , 5, 6, 7, 8,3', 4'-七甲氧基黄酮(3) 、橘皮素(4) 和5􀀂羟基􀀂6, 7, 8, 3', 4'-五甲氧基黄酮(5) 5 种活性黄酮的量。结果􀀁 12 批广陈皮中橙皮苷的量在38 021-70 735 mg/g , 均符合药典标准(≥35mg/g) , 其中, 产于新会的广陈皮中橙皮苷的量低于广东其他两个产地( 高要和龙门) ; 另外, 广陈皮中多甲氧基黄酮类成分的量以川陈皮素、橘皮素为高。结论:该方法简单、准确, 其结果可为广陈皮质量标准的制定提供一定的依据。

    关键词: 广陈皮; 高效液相色谱; 橙皮苷; 多甲氧基黄酮

    广陈皮是我国岭南地区著名的道地药材, 位列十大广药之一。《中国药典》( 2005 年版) 记载, 陈皮为芸香科柑橘属植物橘Citrus ret iculata Blanco 及其栽培变种的干燥成熟果皮, 其药材可分为陈皮及广陈皮, 质量以广陈皮为优。目前对广陈皮药材质量控制已有报道[1] 。广陈皮药材来源较广, 正品为茶枝柑Citrus reticulata ‘Chachi’( 当地叫大红柑)的干燥成熟果皮, 主产于广东新会, 又名新会陈皮。具有理气健脾、和胃止呕、燥湿化痰等多种功效[2]。除挥发油外, 广陈皮主含黄酮类成分。其黄酮类成分有两大类型: 一类是黄酮苷类, 主要为二氢黄酮类成分, 如橙皮苷、柚皮苷等; 一类是多甲氧基黄酮类,主要有川陈皮素、橘皮素、3, 5, 6, 7, 8, 3', 4'-七甲氧基黄酮等。研究结果表明, 多甲氧基黄酮类成分具有抗癌[3] 、抗氧化[4] 、抗诱变[5] 、抗炎[6] 及心血管保护[7] 等多种作用。多甲氧基黄酮类成分广泛存在于芸香科柑橘属类植物中, 随植物来源不同, 该类植物所含多甲氧基黄酮类成分有较大差异[8-11] 。

    􀀂《中国药典》2005 年版是以橙皮苷作为陈皮及广陈皮质量控制的指标成分。然而, 资料及预实验结果表明, 广陈皮中橙皮苷的量往往低于其他陈皮,仅通过单一指标成分已无法说明广陈皮的特色。鉴于此, 除橙皮苷外, 本实验还选择了4个多甲氧基黄酮( 川陈皮素、3, 5, 6, 7, 8, 3', 4'-七甲氧基黄酮、橘皮素、5􀀂羟基􀀂6, 7, 8, 3', 4'-五甲氧基黄酮) 作为指标对来自不同产地的12批广陈皮样品进行了测定, 其结果可为广陈皮质量标准的研究提供一定的参考。

    1 􀀁 仪器与材料

    1.1 􀀁仪器: 高效液相色谱系统: Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪, SPD-20A 紫外-可见分光检测器,7725i 注射阀( 20μL, Rheodyne, USA) , LC solution 色谱工作站软件; Milli-Q plus system 超纯水仪( Millipore, Milfor d, MA, USA ) ; KUDOSSK250 LH 超声波清洗器( 上海科导超声仪器有限公司) ; Anke TDL-5 型台式离心机( 上海安亭科学仪器厂) 。

    1.2 􀀁材料: 广陈皮药材于2007-10 )-2008-12 采自于广东省江门市新会区各镇、高要市水南镇及惠州市龙门县, 经中山大学药学院杨得坡教授、蒋林研究员鉴定为茶枝柑Citrus reticulata‘Chachi’的干燥成熟果皮。橙皮苷(1)、川陈皮素(2)、3, 5, 6, 7, 8,3', 4'􀀂七甲氧基黄酮(3) 、橘皮素(4)、5-羟基-6, 7,8, 3', 4'-五甲氧基黄酮(5)对照品均由笔者从广陈皮药材中制备分离得到, 通过NMR、MS 等方法对其结构进行了鉴定, HPLC 峰面积归一化法测定结果表明其质量分数均大于98%。

    1.3 􀀁试剂: 色谱纯试剂: 乙腈、甲醇( Tedia Company, Fairfield, USA) ; 分析纯试剂: 石油醚、醋酸乙酯、甲醇( 天津市富宇精细化工有限公司) ,甲酸、冰醋酸( 广州化学试剂厂);怡宝纯净水( 怡宝食品饮料有限公司) ;超纯水( 自制) 。

    2 􀀁 方法与结果

    2.1 􀀁 HPLC色谱条件:色谱柱为DIKMA Diamonsil C18 (250mm×4.6 mm, 5μm) ; 流动相: 乙腈-水; 体积流量: 1 mL/ min; 柱温: 25℃ ; 进样量: 20μL; 检测波长: 283及330nm双波长检测。梯度洗脱程序: 0-15 min, 25% -50% 乙腈; 15-35 min,50% -60% 乙腈; 35-40 min, 60%-85% 乙腈。

    在该条件下, 广陈皮药材及对照品色谱图见图1。

    1-5代表黄酮指标化合物

    1-5 numbers indicat e fl avonoids

    图1 􀀁 对照品(A) 及广陈皮药材( B) HPLC 分析色谱图

    Fig.1 HPLC Chromatograms of reference substance (A)

    and Pericarpium Citri Reticulatae (B)

    2.2 􀀁 供试品溶液的制备:取广陈皮药材粉末( 过140 目筛) 0.4 g , 精密称定。精密加入40mL甲醇,超声提取30 min。4000 r/ min 离心5 min, 取上清液,浓缩后定容至25mL。溶液经微孔滤膜滤过,即得。

    2.3 􀀁 对照品溶液的制备: 分别精密称取橙皮苷(1)31.2 mg、川陈皮素(2) 9.6 mg、3, 5, 6, 7, 8, 3', 4'-七甲氧基黄酮(3) 8.6 mg 、橘皮素(4) 10.2 mg 和5-羟基-6, 7, 8, 3', 4'-五甲氧基黄酮(5) 8.9 mg 5种自制对照品, 用甲醇溶解并定容至25 mL, 使之质量浓度分别为1.248、0.384、0.344、0.408、0.356 mg/mL, 并作为对照品贮备液, 冰箱4℃保存、备用。临用前, 用甲醇将储备液稀释到适当浓度, 即为对照品溶液。

    2.4 􀀁 HPLC 色谱条件的优化

    2.4.1 􀀁流动相组成系统的优化: 考察了甲醇-水, 乙腈-水及在流动相中添加不同浓度的酸( 甲酸、乙酸) 对样品分离的影响。结果表明, 采用甲醇-水系统作为流动相时, 黄酮苷类成分有较好的分离, 但多甲氧基黄酮类成分的分离则不理想, 采用乙腈-水系统对多甲氧基黄酮类成分的分离有明显改善; 在流动相中添加不同比例的酸, 对样品各成分的分离影响不大; 采用梯度洗脱较等度洗脱, 能明显改善各特征峰的分离效果, 既能满足基线分离的要求, 又有适宜的保留时间。故实验选用乙腈-水系统作为流动相并采用梯度洗脱方式。

    2.4.2 􀀁检测波长的选择: HPLC-PDA 分析结果表明, 5个黄酮指标成分橙皮苷、川陈皮素、3, 5, 6, 7,8, 3', 4'-七甲氧基黄酮、橘皮素、5-羟基-6, 7, 8, 3',4'-五甲氧基黄酮最大吸收波长分别为283.7、334.4、341.5、323.7、345.1 nm。因此, 选择283 和330 nm 分别作为二氢黄酮类及多甲氧基黄酮类成分的检测波长, 在两个波长下, 色谱峰数量较多、表观峰度高、峰形较好且基线稳定。

    2.5 􀀁 药材提取方法的优化

    2.5.1 提取溶剂的筛选; 采用超声法提取药材。比较了石油醚、醋酸乙酯、乙醇、甲醇4 种不同溶剂对广陈皮黄酮类成分的提取效率。结果表明, 石油醚是一种富集多甲氧基黄酮类成分的良好溶剂, 但提取率低, 且其对橙皮苷的提取率几乎为零; 醋酸乙酯对多甲氧基黄酮类成分有较高的提取率, 对橙皮苷的提取率则较低, 且二者均小于乙醇及甲醇; 乙醇和甲醇均是提取橙皮苷及多甲氧基黄酮类成分的良好溶剂, 但甲醇对橙皮苷的提取率略大于乙醇。因此,实验选择甲醇作为广陈皮黄酮类成分的提取溶剂。

    2.5.2 􀀁 药材粒度的筛选:以上述5 个黄酮化合物为指标, 考察了不同粒度的广陈皮药材粉末40、60、80、100、120、140、160目对提取效率的影响。结果表明, 药材粒度为120 目时, 药材中的橙皮苷提取效率最高, 80、100、140 目次之; 药材粒度为140、160 目时, 多甲氧基黄酮类成分的提取率最高, 且二者大致相当, 橙皮苷的提取率则以140 目时为大。故药材的粉碎度确定为140 目。

    2.5.3 􀀁 溶剂倍量的优化:分别用40、60、80、100、120、150 倍甲醇超声提取药材。经分析测定, 结果表明, 采用100倍甲醇提取, 5个黄酮化合物的提取率均为最高, 故选择100倍体积甲醇提取药材。

    2.5.4 􀀁 超声时间的优化: 考察不同提取时间12、20、30、45 min 对5个黄酮化合物提取效率的影响。结果表明, 超声30min 后, 再延长提取时间并不能提高5个化合物的提取率, 说明提取已经基本完全,且无必要再考察提取次数。故最终优化的提取条件为: 药材过140 目筛, 用100 倍甲醇溶液超声提取30 min, 提取1 次。

    2.6 􀀁 线性范围、检测限及定量限考察: 精密称取对照品储备液, 用甲醇稀释配制成6个质量浓度水平。按2.1 色谱条件, 分别对不同质量浓度的对照品溶液进行分析, 每样重复测定3 次, 取峰面积平均值。分别以对照品1- 5 的质量浓度X (μg/mL)为横坐标、峰面积值Y 为纵坐标进行回归计算。回归方程、线性范围、相关系数见表1。检测限( LOD) 和定量限( LOQ) 分别是当信噪比( S/ N) 为3 和10时, 化合物的质量浓度(μg/mL)见表1。

    表1 􀀁 标准曲线数据表(n= 3)

    Table 1􀀁 Calibration data (n= 3)

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    2.7 􀀁 精密度试验: 分别取低、中、高3 个质量浓度的混合对照品溶液。精密吸取20μL, 注入高效液相色谱仪, 按2.1 色谱条件进行分析。每个质量浓度日内测6 次, 连续测6 d。经计算, 对照品中黄酮类成分1-5 的日内及日间测定质量浓度的RSD 均小于5% , 同时准确度在95.16%-104.71%, 表明测定方法的精密度符合分析要求。

    2.8 􀀁 重现性试验: 取同一批广陈皮药材6 份, 按2.2 项下方法制备供试品溶液。在2.1 色谱条件下, 测定供试品中黄酮成分1.5 的量。经计算, 5个黄酮化合物的保留时间和定量测定值的RSD 均小于3%, 表明测定方法的重现性良好。

    2.9 􀀁 稳定性试验: 取同一份药材, 按2.2 项下方法制备供试品溶液。在2.1 色谱条件下, 分别于0、2、4、6、8、10、2 4、48 h 进样, 测定供试品中黄酮化合物1- 5 的量。经计算, 5个黄酮成分的保留时间和定量测定值的RSD 均小于3%, 表明供试品溶液在48h内稳定。

    2.10 􀀁 回收率试验: 精密称取已测定的样品6 份,每份0.2 g, 精密加入混合对照品溶液, 按2.2 项下方法制得待测溶液, 按2.1 项下方法进样分析, 计算加样回收率。经计算, 1-5 黄酮成分的平均加样回收率依次分别为98.27%、101.08%、97.64%、103.20%、9 6.91% , RSD 值均小于5%。

    2.11 􀀁 样品测定: 12 批不同产地广陈皮药材, 按2.2项下方法处理, 按2.1 项下方法进样, 测定峰面积,用外标法计算药材中5 个黄酮成分的量。计算结果见表2。由表2 可知, 12 批广陈皮中橙皮苷的量在38. 021-70.735 mg/ g , 均符合􀀂中国药典 标准(≥35 mg/g) , 其中, 产于江门新会的广陈皮中橙皮苷的量低于广东其他两个产地( 高要和龙门) ; 广陈皮中多甲氧基黄酮类成分的量以川陈皮素、橘皮素为高, 其量明显高于3, 5, 6, 7, 8, 3', 4'-七甲氧基黄酮、5-羟基-6, 7, 8, 3', 4'-五甲氧基黄酮。

    表2 􀀁 不同产地广陈皮药材中黄酮类化合物1-5 的测定结果(n= 3)

    Table 2 􀀁 Determination of flavonoids 1) 5 in Pericarp ium Citri Reticulate collected from different regions in China ( n= 3)

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    α表示均值, 标准差

    􀀁 􀀁 αData are represented as

    3 􀀁 讨论

    研究结果表明, 不同产地广陈皮药材中各黄酮类成分的量相差甚大, 除生长环境不同外, 该结果还与药材采收时间、贮藏年限等因素相关。由此可知,要全面控制药材质量就要从药材的种植、生产、采收、加工等各个环节全面实现规范化生产, 才能确保药材质量稳定。

    中国药典 ( 2005年版) 采用索氏提取法, 经石油醚脱色、甲醇反复回流提取陈皮药材, 并以橙皮苷为标准, 对药材进行分析测定, 该方法繁琐、耗时。本实验采用超声法提取药材, 并对提取工艺进行了优化, 方法简单、经济。另外, 本实验采用多指标成分对广陈皮主要活性黄酮类成分进行分析测定, 较单一指标更能反映广陈皮道地性特色的物质基础。

    本研究针对广陈皮中主要有效成分群, 首次采用多指标成分建立了HPLC 定量方法对不同产地的广陈皮进行了分析测定, 方法简单、准确, 为广陈皮药材质量标准的制定提供了有益的参考。另外,鉴于广陈皮中富含川陈皮素、橘皮素, 两种成分又有丰富的药理活性, 故在结合橙皮苷制定广陈皮质量标准时, 建议予以充分考虑。

    致谢: 新会农业局、新会陈皮协会、广东省水果苗木繁育场、江门丽宫国际酒店、江门德鑫制药有限公司等单位在样品采集及基地建设方面对本项目工作的大力支持和协助。

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