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道地药材广陈皮的HPLC 指纹图谱研究

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admin 发表于 2013-11-12 11:47:29 | 显示全部楼层 |阅读模式

杨洋,蒋林* ,郑国栋,林乐维,陈金龙,周雯

(中山大学药学院生药与天然药物化学实验室,广东广州510006)

    摘要 目的: 建立新会道地药材广陈皮的HPLC 指纹图谱,并比较与不同产地不同品系来源的陈皮药材相似性,为其品质控制提供依据。方法: 采用HPLC 分析测定26 批陈皮样品。色谱柱: Diamonsil C18 ( 250mm×4.6mm,5μm) ; 流动相: 乙腈-1%乙酸水溶液梯度洗脱; 分析时间:65min; 检测波长:330nm; 流速: 1.0 mL/min。结果: 建立了广陈皮的指纹图谱,确定了17 个共有峰,道地药材相似度大于0.97,不同品系来源药材的相似度存在较大差异。

    结论: 该指纹图谱检测方法简便、重现性好,可作为广陈皮手药材质量控制的重要方法。

    关键词广陈皮; 高效液相色谱; 指纹图谱

HPLC Fingerprint of Pericarpium Citri Reticultae from Guangdong Province

YANG Yang,JIANG Lin,ZHENG Guo-dong,LIN Le-wei,CHEN Jin-long,ZHOU Wen

( Laboratary of Pharmacognosy and Natural Medicine Chemistry,School of Pharmaceutical Sciences,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510006,China)

    Abstract Objective: To establish chromatographic fingerprint of Pericarpium Citri Reticultae from Guangdong province by HPLC and comparison of citrus herbs similarity with different strains and different origin,it was expected to fix standard of quality control.Methods: 26 samples' analysis was performed on Diamonsil C18 column( 250mm×4. 6mm,5μm) with gradient mobile phase of acetonitrile-1% acetic acid,fingerprint was finished in 65 min,the monitoring wavelength was at 330 nm with the flow rate of 1.0 mL/min.

    Results: Establishing the fingerprint of Pericarpium Citri Reticultae from Guangdong province,17 common peaks were found in the HPLC fingerprints from different sources,the similarity of Pericarpium Citri Reticultae from Guangdong province above 0. 975 and quite different for different origin drugs. Conclusion: This method is simple,accurate with good reproducibility,and can be used specifically for the quality control of Pericarpium Citri Reticultae from Guangdong province.

    Key words Pericarpium Citri Reticultae from Guangdong province; HPLC; Fingerprint

    陈皮为芸香科植物橘( Citrus reticulata Blanco)及其栽培变种的干燥成熟果皮,具有理气健脾、燥湿化痰的功能[1]。2005 年版中国药典记载陈皮药材可分为陈皮及广陈皮,陈皮来源于福橘、大红袍、温州蜜柑等多种柑桔植物[2],广陈皮主要来源新会柑( 茶枝柑) 。中国药典中以单一指标成分橙皮苷来控制陈皮的质量,但研究结果表明,其他陈皮所含橙皮苷含量往往比广陈皮高[3],说明这仅一指标成分无法说明广陈皮的特色。解决这个问题的手段之一是建立广陈皮化学指纹图谱,目前,这方面已有文献报道[3-7]。本实验结合前人研究,对广东省道地产区茶枝柑和不同产地不同植物种源的大红袍、温州蜜柑、朱橘、南丰蜜橘、早橘、川橘和砂糖橘进行高效液相色谱研究,建立更具有代表性的广陈皮指纹图谱共有模式图,为其质量控制提供有效方法。

    1 仪器与试药

    1.1 仪器岛津LC-20A 高效液相色谱仪( 双元梯度泵、自动进样器、柱温箱、自动脱气机、PDA 检测器,LC solution 色谱工作站) ; 国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”( 2004AB 版) ;AG285 电子分析天平( METTLER TOLEDO; Swizerland); KQ-250DB 型数控超声波清洗器( 昆山市超声仪器有限公司) 。

    1.2 试药 橙皮苷购买自中国药品生物制品检定所,批号: 110721-200613。川陈皮素、橘皮素自制,经过1H-NMR、13C-NMR、MS 等光谱技术及理化鉴定确定其结构,与参考文献核对数据一致,并经HPLC 峰面积归一化法测定纯度达98%以上。乙腈( 色谱纯,Honeywell 公司) ,自制超纯水,其余试剂均为分析纯。

    1.3 样品各药材样品具体来源见表1,均经中山大学药学院生药及天然药化实验室蒋林研究员鉴定。

    表1 广陈皮各样品来源

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    2 方法与结果

    2. 1 色谱条件色谱柱: 迪马Diamonsil C18 (250mm×4.6 mm,5μm) ; 流动相: 1%乙酸水溶液(B相) : 乙腈(A相) ,梯度洗脱条件: A,0~20 min(10%~25%) ; 20~30min ( 25%~35%) ; 30~60min(35%~70%) ; 60~65 min(70%~75%) 。流速: 1. 0 mL /min,检测波长: 330nm,分析时间: 65min,进样量: 20μL。

    2. 2 供试品溶液的制备称取0.4g 的广陈皮药材粉末( 过140 目筛) ,置50 mL 具塞锥形瓶中,精密加入甲醇40 mL,超声提取30 min,用甲醇补足重量,定溶于25 mL 容量瓶,0.45μm 微孔滤膜滤过备用。

    2. 3 对照品溶液的制备精密称取橙皮苷对照品

    1.62 mg,川陈皮素0.16 mg,橘皮素0.20 mg,甲醇定溶于2 mL 容量瓶中,摇匀,0.45 μm 微孔滤膜滤过,即得。

    2. 4 方法学考察

    2. 4. 1 精密度试验: 取同一供试品溶液,连续进样6次,检测指纹图谱。结果表明: 17 个共有峰的相对保留时间RSD均小于2%,相对峰面积RSD均小于3%,说明供试品进样精密度良好。

    2. 4. 2 重复性试验: 取同批样品6 份,分别制备供试品溶液进行分析。结果表明: 17 个共有峰相对保留时间RSD 均小于2%,相对峰面积均小于3%,说明本法测定的重复性良好。

    2. 4. 3 稳定性试验: 取同一供试品溶液,分别于0、2、4、8、12、24 h 进样6 次。结果表明: 17 个共有峰的相对保留时间RSD 均小于2%,相对峰面积均小于3%,说明24h内供试品溶液稳定性较好。

    2. 5 指纹图谱分析及评价

    2. 5. 1 不同产地广陈皮药材指纹图谱的建立: 取陈皮药材,按“2. 2”项下方法制备供试品溶液,将供试品溶液和对照品溶液按“2. 1”项下色谱条件分别进样,进行分析测定,建立得样品HPLC色谱图。10批广陈皮指纹图谱见图1。

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    图1 广陈皮指纹图谱

    2. 5. 2 广陈皮药材共有模式指纹图谱的建立: 将10批药材的色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统( 2004A 版) ”软件进行数据处理,选择橙皮苷,川陈皮素和橘皮素三个色谱峰进行多点校正,色谱峰自动匹配后,以中位数法生成广陈皮共有模式指纹图谱。见图2。有17 个峰为10 批样品所共有,其中9峰为橙皮苷,13 峰为川陈皮素,15 号峰为橘皮素。以保留时间为26.708 min 的9号色谱峰作为参照峰,计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积,具体数据见表2、表3。各样品出峰总数及共有峰占总峰面积百分比见表4。经统计共有峰面积占总峰面积百分比为94. 77% ~97. 73%,非共有峰面积与总峰面积的百分比为2. 27% ~ 5. 23%。符合指纹图谱研究的非共有峰占总峰面积百分比<10%的技术要求。

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    图2 广陈皮共有模式图

    表2 广陈皮各样品共有峰相对保留时间

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    表3 广陈皮各样品共有峰相对峰面积

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    表4 广陈皮各样品共有峰面积

    2. 5. 3 陈皮药材相似度评价: 将10 批道地药材和17 批其他品种陈皮药材的色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统( 2004B 版) ”,以广陈皮共有模式为标准,进行整体相似度评价,具体数据见表5。广陈皮相似度高达0.975~0.998,其他陈皮相似度除广东高要与惠州的茶枝柑相似度为0.975和0.978 外,其他品系来源的陈皮相似度为0.677 ~0.939,均小于0.940,与广陈皮相比具特征性差异。

    表5 广陈皮各样品相似度

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    3 讨论

    3. 1 对照品的选择本实验除了选用橙皮苷做对照品外,还选用了川陈皮素与橘皮素两种吸收比较大的峰作为对照进行多点校正,后两者属于多甲氧基黄酮类成分,有抗癌[8,9]、抗炎[10]、抗氧化[11]、抗真菌、抗动脉粥样硬化和降低血清胆固醇[12,13]等药理活性,更精确地建立广陈皮指纹图谱共有模式图和质量评价体系。

    3. 2 色谱条件的选择本实验考察了甲醇-水,甲醇-乙酸水溶液,乙腈-水,乙腈-乙酸水溶液等流动相体系,以乙腈-1%乙酸水溶液系统洗脱可使色谱峰较好分离,故选用该系统。本实验经PDA 检测器分析,三个较大峰面积的橙皮苷,川陈皮素和橘皮素的紫外吸收分别是283nm,330nm 和330nm,且在330nm 波长下色谱峰信号丰富,所以选定330nm为检测波长。文献报道多采用283nm 下进行橙皮苷含量测定。陈皮中橙皮苷含量很高,在色谱图中占绝对优势,其他特征峰很弱,为了反应药材化学成分的全貌,可使用不同的检测波长,突出其他特征峰,相互参照辨认,并可避免图谱中仅有一种成分偏高的现象。本研究为图谱中除突出橙皮苷色谱峰特征外,也同时突出其他特征,故选330nm检测。

    3. 3 广陈皮指纹图谱的专属性对实验结果进行相似度评价,广东高要和惠州龙门的茶枝柑与新会茶枝柑的指纹图谱较为相似,其他各品种与广陈皮的相似度相差较远( 相似度: 广陈皮≥0.975,南丰蜜橘、砂糖橘、大红袍的相似度较高,分别为0. 918、0.939 和0.940,其他≤0.766) 。能一定程度上鉴定广陈皮的道地性。

    陈皮药材HPLC 指纹图谱相关研究已有报道。徐润娟等[4]建立了基于不同年份的340 nm 下含9个峰的新会柑皮的高效液相指纹图谱共有模式; 黄月纯等[5]对广东产的13批广陈皮及13 批市售其他品种陈皮指纹图谱进行了研究,建立了283nm 下含7 个峰的共有模式图,区分了市售广陈皮和陈皮; 付玉梅等[6]基于陈皮药材水提物建立了含9 个共有峰的共有模式图; 易伦朝等[3]考察了正品陈皮和9个省、直辖市市场流通陈皮的质量,认为柚皮、红光橙皮、温州蜜桔皮和砂糖桔皮与陈皮的特定( 指纹) 图谱存在明显差别; 而丁春光等[7]则对不同贮存年限的陈皮指纹图谱进行了研究。

    本实验依据中国药典中和市场上的常用于用作陈皮的品种作为样品来源,在借鉴前人的工作基础上,建立了更为丰富和更具代表性的指纹图谱共有模式图,共含有17 个共有峰,且三个主峰化合物明确,在一定程度上能快速鉴别区分不同来源的陈皮药材。本研究通过指纹图谱对陈皮药材进行综合宏观分析,有利于药材质量的全面控制,也为进一步研究广陈皮的道地性奠定了基础。

    参考文献

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    [2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典[S]. 一部. 北京: 化学工业出版社,2005: 132.

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    [4] 许润娟,张芳红. 新会柑皮HPLC 指纹图谱的研究[J].中药材,2005,28( 7) : 596-599.

    [5] 黄月纯,魏刚. 广陈皮HPLC 指纹图谱的建立及在药材鉴定中的应用研究[J]. 中草药,2008,39( 2) : 275-277.

    [6] 付玉梅,张俐伟,伍振峰,等. 陈皮药材水提物的HPLC特征指纹图谱研究[J]. 中成药,2006,28( 1) : 8-10.

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    [13] Kurowska E M,Manthey J A. Hypolipidemic effects and absorption of citrus polymethoxylated flavones in hamsters with diet-Induced hypercholesterolemia[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2004,52 ( 10 ) : 2879-2886.

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