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高速逆流色谱分离制备广陈皮中多甲氧基黄酮类成分的研究

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admin 发表于 2013-11-12 11:55:41 | 显示全部楼层 |阅读模式

郑国栋1 , 周 芳2 , 蒋 林1, 杨得坡1 , 杨 雪1 , 林乐维1

( 1􀀁 中山大学药学院生药与天然药物化学实验室;

2 湖南中医药大学药学院天然药物化学实验室)

    摘 要: 目的􀀁 采用高速逆流色谱技术(HSCCC) 从广陈皮中制备分离高纯度多甲氧基黄酮类成分。方法􀀁 应用制备型高速逆流色谱仪, 通过优化各分离条件, 以四元两相溶剂系统石油醚-醋酸乙酯-甲醇-水( 1:08:07:08) ,上相为固定相, 下相为流动相, 制备分离广陈皮醋酸乙酯萃取部分粗提物。结果300 mg 粗提物经过260 min 一次制备分离, 得到了3 个多甲氧基黄酮类化合物, 经EI-MS 及1H-NM R 分析, 鉴定为川陈皮素、3 , 5, 6, 7, 8, 3', 4'-七甲氧基黄酮及橘皮素, 其质量分数分别为96.25%、97.10%、99.22%。结论􀀁 该方法简便、经济, 所得化合物既可作为广陈皮质量控制的参考物质, 又可为柑橘属植物分类学研究提供一定的依据。

    关键词: 广陈皮; 多甲氧基黄酮; 高速逆流色谱

Isolation and purification of polymethoxylated f lavonoids from Pericarp ium Citri Reticulatae

by high-speed counter-current chromatography

    ZHENG Guo-dong1 , ZHOU Fang2 , JIANG Lin1 , YAN G De-po1 , YANG Xue1 , LIN Le-wei1

    ( 1. Labo rato ry o f Pharmaco gnosy and Nat ur al Medicinal Chemistr y, Schoo l of Pharmaceut ical Sciences, Sun Yat-sen University, Guang zho u 510006, China; 2. Labor ator y of Natural Medicinal Chem istry , Colleg e of Pharmaceutical Sciences of H unan Univer sity o f Chinese Medicine, Chang sha 410208, China)

    Abstract: Objective Hig h speed counter-current chromato graphy ( HSCCC) w as applied to the pr e􀀂

    parat ive separation o f po lymethoxy lated f lav onoids ( PMFs) w ith high purity fr om Peri carp ium Cit ri Ret iculatae. Methods After various par ameters of prepar at ive HSCCC were optimized preliminarily, the crude ext ract of the EtOAc par t of Per icar p ium Cit ri R eti culatae w as separated with a two-phase solvent system compo sed of pet roleum etherEtOAc-methano l -w ater ( 1 :0. 8 :0.7 :0.8). T he upper phase w ascho sen as the stat ionar y phase, w hile the low er phase w as chosen as the mo bile phase Results T hree PMFs including nobilet in, 3, 5, 6, 7, 8, 3', 4'-heptamethox y flavo ne, and tangeret in could be o btained from 300 mg crude ext racts in one-step separat io n in 260 min w ith their purit ies as 96.25% , 97.10% , and99.22% , respectively. And their st ructur es w ere identif ied by EI-MS and 1H-NMR. Conclusion There

    sult s demonstr ate that the adopted metho ds are simple, feasible, economical, and eff icient for rapid preparat ive iso lation of PMFs f rom species of Ci tr us L. The compo unds obtained in the ex periment could be used as reference substances for quality co nt ro l of P er icar p ium Ci tr i Reti culatae. Furthermore, the adopted methods may be used as st rong research to ols fo r taxo nomy in bo tanical sciences o f Cit rus L.

    Key words: Per icarp ium Ci tr i R eti culatae; polymethox ylated f lavonoids ( PMFs) ; high speed counter-cur rent chr omatogr aphy ( HSCCC)

    广陈皮是广东著名的传统中药材, 位列十大广药之一。《中国药典》2005 年版记载, 陈皮为芸香科植物橘Ci tr us reti culata Blanco 及其栽培变种的干燥成熟果皮, 其药材可分为陈皮及广陈皮, 质量以广陈皮为优。广陈皮药材来源较广, 正品为茶枝柑Ci tr us r et iculata ‘Chachi’的干燥成熟果皮, 主产于广东新会, 具有理气健脾、和胃止呕、燥湿化痰等多种功效。广陈皮含有丰富的多甲氧基黄酮类成分,其可作为芸香科柑橘属分类的指标性成分。该类成分具有显著的药理活性, 如抗癌[2] 、抗诱变[3] 、抗炎[4]、抗氧化[5] 及心血管保护[6] 等作用。故本课题拟采用高速逆流色谱( high speed counter􀀂curr entchr omatogr aphy, HSCCC) 技术制备分离广陈皮多甲氧基黄酮类成分, 由于该技术不使用载体, 没有不可逆吸附, 具有样品无损失、无污染、高效、快速和大制备量分离等优点, 并使常规提取分离无法分离得到的一些微量及死吸附成分的获得成为可能, 现已广泛成功应用于天然产物有效成分的分离制备[7-9]。

    1 􀀁 仪器与材料

    高速逆流色谱系统: Mk5 QuikPrep 500 制备型高速逆流色谱仪(英国AECS Co.) , LC-SeriesⅡ液相泵(美国SSi Co) , 不锈钢线圈管路PTFE preparat ive coil(直径2.16mm, 总容积450mL, 选择容积230mL, 转速0-860 r/min) , 20mL定量环,SPD-10AVP 紫外检测器(日本岛津) ; 高效液相色谱系统: Waters 600E 型高效液相色谱仪(美国Milford) , Waters 2996 二极管阵列检测器, Waters 717plus 自动进样器, Empower色谱工作站软件; MilliQ plus system 超纯水仪(美国Millipor e) ; 电子轰击电离质谱仪( TraceDSQ, Thremo, USA ) ; Br uker Avance AV 400 超导核磁共振谱仪(瑞士Bruker) ;Varian INOVA 500NB 超导核磁共振谱仪(美国Varian) ; EYELA 旋转蒸发仪(日本东京) 。

    广陈皮药材于2007年12 月采自广东省江门市新会区双水镇广东省水果良种苗木繁育场, 经中山大学药学院蒋林研究员鉴定为茶枝柑Creti culata‘Chachi’ 的干燥成熟果皮。乙腈、甲醇为色谱纯试剂, 其他试剂均为分析纯试剂, 怡宝纯净水(怡宝食品饮料有限公司), 超纯水(自制) 。

    2 􀀁 方法与结果

    2.1 􀀁 样品预处理: 1kg 干燥广陈皮打成粗粉、过20目筛, 用80%乙醇回流提取3 次、每次1.5 h、合并提取液, 提取液浓缩至无醇味并用水分散, 依次用石油醚( 60-90℃) 、醋酸乙酯分别萃取6次, 合并萃取液, 醋酸乙酯萃取部分减压浓缩得醋酸乙酯浸膏样品10 g。

    2.2 􀀁 HPLC 样品分析: 迪马Dikma Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6 mm, 5μm) ; 流动相:乙腈-水(50-50) ; 进样量: 10μL; 体积流量: 1.0 mL/ min;检测波长: 330 nm; 柱温: 25℃。样品经分离后, 显示5个主要色谱峰, 见图1。

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    图1􀀁 广陈皮醋酸乙酯萃取部分HPLC 色谱图

    Fig􀀁 1􀀁 HPLC Chromatogram of EtOAc crude extract from Pericarpium Citri Reticulatae

    2.3 􀀁 溶剂系统筛选: 以试管法结合高效液相色谱法测定高速逆流色谱溶剂系统的分配系数k 值(k=C固定相/C流动相, 0.5≤k ≤2) [10] , 以之为依据, 对四元两相溶剂系统石油醚-醋酸乙酯-甲醇-水进行筛选。结果表明, 石油醚-醋酸乙酯-甲醇-水( 1 :0.8: 0.7:0.8) 为最佳溶剂系统, 除峰A 外, 峰B- E 的k 值均在0.5-2, 见表1。

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    表1 􀀁 广陈皮醋酸乙酯萃取部分HSCCC 溶剂系统筛选

    Table 1􀀁 Selection of two􀀂phase solvent system for EtOAc

    crude extract from Pericarpium Citri Reticulatae

    2.4 􀀁 其他分离条件优化

    2.4.1 􀀁固定相及流动相选择: 以所选溶剂系统下相为固定相, 上相为流动相时, 分离时发现基线不稳定, 且在分离过程中一直伴随固定相的流失, 固定相保留率较低、分离时间长, 故选择溶剂系统上相为固定相, 下相为流动相。

    2.4.2 􀀁 样品质量浓度的选择: 固定进样体积为20mL, 逐步提高进样质量浓度分别为5、10、15、20mg/mL, 发现以20 mg/mL为进样质量浓度时, 会导致峰分离效果变差及固定相流失, 故选择15mg/mL为适宜进样质量浓度。

    2.4.3 􀀁转速、柱温及流动相体积流量的选择: 预试验结果表明, 转速越快, 固定相保留率越高; 柱温过低, 会带来固定相的流失, 柱温过高, 则溶剂系统在分离过程中易出现大量气泡, 从而影响分离; 流动相体积流量过低会导致分离周期延长, 过高则会导致固定相流失且分离效果变差。故经综合考虑, 转速、柱温及流动相体积流量分别设定为860r/min、35℃及2 mL/min。

    2.5 􀀁 HSCCC 制备分离: 溶剂系统为石油醚􀀂醋酸乙酯􀀂甲醇􀀂水( 1:0.8 :0.7 :0.8) ; 固定相: 上相; 流动相: 下相; 线圈容积: 230mL; 进样量: 300mg; 进样体积: 20mL; 转速: 860r/min; 流动相体积流量: 2mL/min; 检测波长: 330nm; 柱温: 35℃; 固定相保留率: 78%。300mg 样品经260min一次制备分离, 得到A- E 5个组分, 见图2。其中, A、B 未能完全分离, C、D、E 则得到了良好的分离。组分A-E 经浓缩干燥后, 称定质量, 分别为20、16、22、3、8mg。

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    图2 􀀁 HSCCC制备分离广陈皮醋酸乙酯萃取部分色谱图

    Fig􀀁 2 􀀁 Preparative HSCCC separation of EtOAc crude

    extract from Pericarpium Citri Reticulatae

    2.6 􀀁 HPLC-PDA 对质量分数的分析: 组分A-E经HPLC-PDA 分析( 色谱条件见2.2) 、按峰面积归一化法计算质量分数。结果表明, 组分A、B 不纯, 其主要成分质量分数分别为86.03%、86.41% , 尚需进一步纯化处理, 组分C、D、E 则较为纯净, 其质量分数分别为96.25%、97.10%、99.22%, 结果见图3。

    2􀀁 7 􀀁 化合物结构鉴定

    化合物C: 无色针状结晶( 甲醇) , mp 133-134℃,分子式C21H22O8。EI-MS m/z(%) :402(M+)、387(M+ - CH3 , 100)、371 ( M+ -OCH3 ) 、357、344、326、255、197、182、162、149、131、111、97、8 3、69、57。1H-NMR (400MHz, CDCl3 ) 􀀂δ: 7.56( 1H, dd, J=8.4, 2􀀁 0 Hz, H-6') 、7.41 (1H, d, J = 20 Hz, H2')、6.99(1H,d,J= 8.4 Hz, H-5') 、6.61(1H, s, H-3) 、4.10( 3H, s, OCH3) 、4.02( 3H, s, OCH3) 、3.97(3H, s, OCH3) 、3.95( 9H, m, 3×OCH3) 。其光谱数据与文献报道对照基本一致[11] , 故化合物C 鉴定为5,6, 7, 8, 3', 4'􀀂六甲氧基黄酮(川陈皮素) 。化合物D: 黄色针状结晶( 甲醇) , mp 130-131℃,分子式C22 H24O9。EI-MS m/z(%):432(M+) 、417(M+-CH3 ,100)、401、387、374、359、225、209、202、197、187、173、165、149、137、119、107、83、77、69。1H-NMR(400MHz, CDCl3)δ: 7.83 ( 1H, dd, J=8.4, 2.0Hz, H-6') 、7.81( H, d, J= 2.0 Hz, H-2') 、

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    图3􀀁 化合物C-E 的HPLC&#1048578DA 纯度分析色谱图

    Fig􀀁 3􀀁 HPLC&#1048578DA Purity analysis of compounds C-E

    7.06(1H,d,J = 8.4 H z, H-5') 、4.09 (3H,s,OCH3) 、4.00(3H, s, OCH3) 、3.98(3H , s, OCH3) 、3.97(6H, m,2 , OCH3 ) 、3.95(3H, s, OCH3) 、3.89(3H, s, OCH3) 。其光谱数据与文献报道对照基本一致[12] , 故化合物D 鉴定为3, 5, 6, 7, 8, 3', 4'-七甲氧基黄酮。

    化合物E:无色针状结晶(甲醇), mp 159-160℃,分子式C20 H20 O7 。EI-MS m/z:372 (M+)、357(M+-CH3, 100)、329、314、296、268、225、197、182、179、157、153、135、132、117、89、83、69。1H-NMR(500MHz, CDCl3)δ: 7.87( 2H, d, J = 9.0Hz, H-2', 6') 、7.02 (2H, d, J= 9.0 Hz, H-3', 5') 、6.60(1H, s, H-3) 、4.10(3H, s, OCH3) 、4.02(3H,s, OCH3) 、3.95 (6H, s, 2 , OCH3) 、3.89 (3H, s,OCH3) 。其光谱数据与文献报道对照基本一致[13] ,故化合物E 鉴定为5, 6, 7, 8, 4'􀀂五甲氧基黄酮( 橘红素) 。化合物C-E 的结构式见图4。

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    图4 􀀁 化合物C-E的结构式

    3 􀀁 讨论

    在应用HSCCC技术制备分离天然产物化学成分的过程中, 良好溶剂系统的选择是关键。可根据需要选用二元、三元或多元溶剂系统, 并控制上下两相分层时间在30s 以内, 且不能出现乳化现象, 通过简单试管法结合薄层色谱、高效液相色谱、毛细管电泳等方法计算k 值, 尽量控制其值在0.5-2, 从而确定最佳溶剂系统。另外, 固定相及流动相的选择、样品进样量、转速、流动相体积流量、柱温等亦是考察的重要指标。

    在选择最佳溶剂系统时, Ito[10] 认为应控制α值1.5(分离度,α=k2/k1 ,k2>k1) 。笔者认为在进行多组分分离时, 该条件不仅难以实现, 且并无太大必要, 适当控制k值在0.5-2 即可。本实验选用的溶剂系统,αAB 、αBC、αCD、αDE 经计算分别为2.23、2.02、1.26、1.36, 化合物C、D、E依然得到了良好的分离。

    在薄层色谱预试验中, 发现在采用各种不同展开剂的条件下( 如石油醚-醋酸乙酯, 石油醚-丙酮等不同比例溶剂系统) , 化合物D(3, 5, 6, 7, 8, 3', 4'-七甲氧基黄酮) 及E( 橘红素) 其Rf值总相同, 且由于其相对分子质量接近, 难以通过常规分离手段分离。实验采用HSCCC 技术, 经一次制备分离, 得到了高纯度的两种化合物, 该方法简单、可行, 其结果不仅可作为参考物质进一步应用于广陈皮的质量控制研究,又可为柑橘属的植物分类学研究提供一定的依据。

    致谢: 新会农业局、新会陈皮协会、广东省水果苗木繁育场及新宝堂陈皮有限公司等单位在样品采集及基地建设方面对本项目工作的大力支持和协助。

    参考文献:[1] 􀀁 T homas W􀀁 Methoxylated f lavones , a superior cancer chemo􀀂prevent ive f lavon oid su bclass [ J]􀀁 S emin Cance r Bi ol , 2007,17( 5) : 354-362􀀁; [2] 􀀁 Li S M, Pan M H , Lai C S , et al􀀁 Isolat ion and syn th es es of pol ymethoxyf lavones and hydroxylat ed polymethoxyfl avones as inhib it or s of H L􀀂60 cell l ines [ J ] 􀀁 Bi oorg Med Chem ,2007, 15( 10) : 3381-3389􀀁;

    [3] 􀀁 M ust af aev O N, Abilev S K, Melnik V A, et al􀀁 St ru cture􀀂activity relat ionsh ips of an tim ut agenic f lavonoids [ J ]E kol ogi che skay aG enet i ka , 2005, 3( 4) : 11-18􀀁; [4] 􀀁 Li S M, San g S M, Pan M H, et al.Antinfl amm at oryp ropert y of the u rinary metabolit es of nobilet in in mouse [ J]􀀁B i oorg Med Chem L e tt , 2007, 17( 18) : 5177-5181􀀁; [5] 􀀁 M iyak e Y􀀁 Characterist ics of f lavonoids in Niihime f ruit 􀀂 a new s our cit rus f ruit [ J ].Food Sc i Tec hnol R es , 2006, 12(3) : 186-193􀀁; [6] 􀀁 Guthri e N, Kur ow s ka E M , Man they J A, et al􀀁 Com posi􀀂t ions and meth od s of t reat ing, redu cing and prevent ing cardio􀀂vascul ar diseases and dis orders w ith polymethoxyfl avones[P].US: U S 06987125, 2006􀀂01-17􀀁;[7] 􀀁 Liu R, Lu Y B, Wu T X, e t al􀀁 Simu lt aneous is ol at ion and pu rifi cat ion of mollugin and tw o anthraquinones f rom R ubiacordifolia by HSCCC [ J ].Chromat og rap hia, 2008, 68 ( 1-2) : 95-99􀀁;[8] 􀀁 Wan g X, Liu J H , Zhang T Y, et al􀀁 Rapid an d simpl e meth􀀂od for qual ity cont rol of raw mat erials of h erbs by H SCCC [J].J L iq Chromat og r R T , 2007, 30( 17) : 2585-2592􀀁;

    [9] 􀀁 Yang C J, Li D X, Wan X C􀀁 Combinat ion of H SCCC and S ephadex LH􀀂 20 m ethods􀀂An appr oach t o isolat ion an d puri􀀂ficat ion of the main individual th eaflavins f rom bl ack t ea [J].J Chr omat og r B , 2008, 861( 1) : 140-144􀀁;

    [10] 􀀁 It o Y􀀁 Golden rules and pit fall s in s elect ing opt imum condi.tions f or high speed coun ter􀀂 current chr om at ography [ J ].JChr omat og r A , 2005, 1065( 2) : 145-168􀀁;[11] 􀀁 Li S M, Lo C Y, Ho C T􀀁 H ydroxylated pol ymeth ox yf lavones and methyl at ed f lavon oids in sw eet orange ( Ci t russinensi s ) peel [J].J A gr i Food Ch em , 2006, 54( 12) : 4176-4185􀀁;

    [12] 􀀁 Web er B, H artman n B, St ockigt D, et al􀀁 Liquid ch rom at og􀀂raphy mass spect rom et ry and l iqu id ch romat ography/ nuclearm agnet ic res on ance as complemen tary analyt ical t echniques for u nam biguous ident if icat ion of polym ethoxyl at ed fl avones in residu es f rom m olecular di st illati on of orange peel oi ls(Ci t rus sinensis ) [J].J A gr F ood Chem , 2006, 54( 2) : 274-278􀀁;[13] 􀀁 Wan g D D, Wang J, H uang X H , et al􀀁 Ident if icati on of p ol ymethoxyl at ed f lavon es f rom gr een t an gerine peel ( Per I c arp ium Ci t ri Ret ic ula tae Vir ide ) by chr om at ographic and s pectr os copic t echniques [J].J Phar m Bi omed , 2007, 44(1) : 63-69

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